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글 수 369
| 발행년 : | 2017 |
|---|---|
| 구분 : | 학위논문 |
| 학술지명 : | |
| 관련링크 : | http://www.riss.kr/link?id=T14357848 |
CRISPR/Cas9 기반 후성유전 편집 기술을 이용한 유전자 발현 조절 연구 : Regulation of gene expression via altered promoter methylation using CRISPR/Cas9-mediated epigenetic editing system
- 저자
박진석
- 형태사항
26 cm
- 일반주기
지도교수: 김용삼
- 학위논문사항
Thesis(M.A.)-- 과학기술연합대학원대학교 : 생체분자과학전공(Biomolecular Science) 2017. 2
- 발행국
대한민국
- 언어
영어
- 출판년
2017
- 초록 (Abstract)
- 최근 후성유전학에 대한 많은 관심과 연구에도 불구하고 후성유전인자조절 방법의 제한과 위치 비특이적인 한계점으로 인해 후성유전학 연구는 제약적일 수밖에 없었다. 지금까지, DNA 메틸화를 조절하기 위한 방법으로 약물 처리 방법이 주로 이용되었지만 이러한 방법은 표적 유전자에 특이적이지 못하고 전체 유전자에 광범위한 영향을 미친다는 단점을 가지고 있다. 하지만 CRISPR/Cas9과 같은 유전자 교정 기술의 발달로 인해 특정 부분의 후성유전인자를 선택적으로 조절할 수 있게 되었고, 이에 우리는 CRISPR/Cas9을 이용해 CpG dinucleotide에 존재하는 메틸기를 선택적으로 조절하여 유전자 발현 유도 가능성을 보여주고자 하였다. 이 논문에서 우리는 프로모터 부위의 과메틸화에 의해 전사가 억제되어 있다고 알려진 Oct4 유전자를 대상으로 CRISPR/Cas9 유전자 교정 도구를 이용한 두 가지 방법을 구축하여 해당 부위의 선택적인 탈메틸화 유도 및 유전자 발현을 유도하였다. 먼저, CRISPR/Cas9 knock-in 교정 기술을 이용하여 Oct4 프로모터와 proximal enhancer에 위치하는 CpG 염기서열을 메틸화가 불가능한 염기서열 조합으로 변형시킨 교정 세포를 구축하였다. 두 번째로, 염기서열의 변형 없이 DNA 메틸화만 선택적으로 제어하기 위해 우리는 Oct4 프로모터를 표적하는 가이드 RNA와 불 활성화된 dCas9, 그리고 탈메틸화 효소인 Tet1의 활성부위가 결합된 dCas9-Tet1 시스템을 완성하였다. 이러한 방법을 통해 우리는 Oct4 프로모터의 위치특이적인 탈메틸화를 유도하였고 유전자 발현 증가를 확인하였다. 또한, DNA 메틸화와 동반된 히스톤 수식화 조절이 Oct4 유전자 발현에 시너지 효과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 Oct4 유전자는 DNA 메틸화뿐만 아니라 염색질 개조와 같은 후성유전학적인 요인들에 의해 그 발현이 엄격히 조절되는 것을 확인하였다. 이로써 우리는 유전자 편집 기술을 이용한 표적 유전자의 후성유전학 적 조절법을 확립하였다. 이러한 연구 방법은 후성유전학 연구에 획기적인 전기를 마련할 뿐만 아니라, 유전자 치료 분야로 적용이 가능할 것으로 기대된다.
- 목차 (Table of Contents)
- Ⅰ. Introduction
- Ⅱ. Material and Method
- 1. Cloning
- 2. Culturing and transfection of NIH3T3 ·
- 3. Analysis of DNA methylation
- 4. Confirmation of indel mutation and knock-in assay
- 5. RNA extraction and quantitative real-time PCR
- 6. Western blotting
- Ⅲ. Results
- 1. Concept of selective demethylation using CRISPR/Cas9 knock-in system
- 2. Confirmation of increased Oct4 expression in engineered cell lines
- 3. Demethylation effects of dCas9-Tet1 modules targeting Oct4 promoter region
- 4. Synergetic effects of histone modifications and DNA methylation on Oct4 expression
- Ⅳ. Discussion
- Ⅴ. Conclusion
- VI. References
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