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글 수 4,668
| 발행년 : | 2018 |
|---|---|
| 구분 : | 학위논문 |
| 학술지명 : | 학위논문(박사)-- 충북대학교 : 의학과(원) 생화학 |
| 관련링크 : | http://www.riss.kr/link?id=T14909780 |
인간배아줄기세포에서 조혈모세포로의 분화법 개발
= Establishment of a method to differentiate human embryonic stem cells into hematopoietic stem cells
- 저자[authors] 김소정
- 발행사항 청주 : 충북대학교, 2018
- 형태사항[Description] 78 ; 26 cm
- 일반주기명[Note] 지도교수: 김응국
- 학위논문사항[Dissertation] 학위논문(박사)-- 충북대학교 : 의학과(원) 생화학 2018. 8
- 발행국(발행지)[Country] 충청북도
- 출판년[Publication Year] 2018
- 주제어 배아줄기 줄기세포,조혈모 세포,제노 -프리 분화법,Embryonic stem cell,Hematopoietic stem cell,Xeno-free culture method
- 소장기관[Holding] 충북대학교 도서관 (243009)
- UCI식별코드 I804:43009-000000051075
초록[abstracts]
Embryonic stem cells (ESCs) are undifferentiated cells that have the potential to self-renew and differentiate into multiple cell types. ESCs are thus considered a useful source of cells for regenerative medicine, drug screening and toxicity testing, developmental studies, disease modeling, and clinical therapeutics.
Several differentiation methods to differentiate ESCs into hematopoietic stem cells (HSCs) have been developed, but they do not meet the requirements for clinical application. First, contamination of the differentiated human stem cells with mouse-derived stromal cells or animal-derived components from the differentiation medium can occur. Moreover, it is difficult to deliver cytokines evenly to the embryonic body because of its three-dimensional structure.
Here, I sought to establish a clinically applicable method to differentiate ESCs into HSCs. I set up three distinct media conditions for differentiation of ESCs: MIM-1(Mesodermal induction medium-1) culture medium, in which fetal bovine serum and mouse-derived stromal cells were replaced by a knockout serum and an extracellular matrix, respectively; MIM-2(Mesodermal induction medium-2) culture medium, whose constituents included essential cytokines for mesodermal differentiation plus MIM-1 medium; and MIM-3(Mesodermal induction medium-3) culture medium, whose constituents included those of the MIM-2 medium minus the knockout serum substitute.
MIM-1, MIM-2, and MIM-3 all exhibited a potential to differentiate ESCs into HSCs, and further into various hematopoietic cells as assayed by a colony formation test. MIM-3 had greater potential than MIM-1 and MIM-2 for the induction of mesoderm differentiation as detected by lower expression of the Oct4 gene and higher expression of mesoderm-related genes, such as Brachyury and Wnt3A. In general, the expression levels of Oct4, Nanog, and Brachyury decreased in a time-dependent manner during longer culture of HSCs in these media. MIM-3 also induced KDR, a marker for late mesodermal cells, and increased the population of CD34+ and CD45+ HSCs to a greater extent than did MIM-1 and MIM-2.
In this thesis, I have successfully established a distinct xeno-free culture method to differentiate ESCs into HSCs by testing three different methods. This method excluded contamination by animal-derived substances for clinical application, but, its low differentiation efficiency remains to be improved.
초록[abstracts]
배아줄기세포는 세포배양조건에서 무한히 자가복제 할 수 있고, 조혈모세포를 포함한 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 배아줄기세포는 조혈모세포의 생산을 위한 세포원천으로 여겨지고 있다. 따라서, 현재 배아줄기세포로부터 조혈모세포를 만들기 위한 다양한 방법들이 개발되고 있지만, 세포치료제로 임상에 적용하기 위해서는 보다 많은 연구가 필요한 실정이다. 기존에 알려진 조혈모세포 분화법은 줄기세포를 마우스 유래 기질세포와 함께 배양하거나, 동물 유래성분을 포함하는 배지를 사용하는 문제점이 있다. 또한 배아체를 이용한 분화유도 방법은 배아체의 입체적인 구조로 인해 사이토카인의 균일한 전달이 어렵다. 이러한 조혈모세포 분화법의문제점들은 분화 및 임상에 적용 시 반드시 개선되어야만 한다. 본 연구의 목표는 이러한 문제점을 해결함으로서 임상에 적용 가능한 조혈모세포로의 분화법을 개발하는 것이다.
일차적으로 본 연구에서는 조혈모세포를 분화하는데 가장 중요한 중배엽 분화단계에서 세 가지 다른 조성의 분화조건, 즉 배지조성과 처리기간에 따른 차이를 검증하였다. 중배엽유도배지-1 (Mesodermal induction medium-1; MIM-1)은 기존에 알려진 분화조건에서 소태아혈청과, 마우스 유래 기질세포를 제외한 조성으로, 소태아혈청 대신 녹아웃혈청대체제, 마우스 유래 기질세포 대신 세포외기질(extracellular matrix)을 사용하였다. 중배엽유도배지-2 (Mesodermal induction medium-2; MIM-2)는 중배엽유도배지-1에서 중배엽 분화에 필수적인 사이토카인 외에는 첨가하지 않은 조건이다. 마지막으로 중배엽유도배지-3 (Mesodermal induction medium-3; MIM-3)는 중배엽유도배지-2 에서 녹아웃 혈청 대체제를 첨가하지 않은 조건이다. 세 가지 조건의 분화배지로 중배엽 분화를 유도했을 때, MIM-3의 Oct4 유전자(미분화 관련유전자)의 발현이 MIM-1과 MIM-2에 비해 낮았고, Brachyury, Wnt3A 유전자(중배엽 관련유전자)의 발현이 MIM-1과 MIM-2에 비해 높았다. 또한 MIM-3의 중배엽 관련 유전자는 7일보다 4일째 더 높았다. 4일 동안 세 가지 조건의 배지로 중배엽 분화를 유도했을 때, 대조군인 H9세포에 비해 Oct4의 발현은 낮고, Brachyury의 발현은 높게 나타나는 것을 면역세포화학염색 결과로 확인할 수 있었다. 다음으로, 4일 동안 세 가지 조건의 중배엽 분화배지로 분화한 세포를,조혈모세포 분화배지로 7일 더 분화를 진행하였다. 조혈모세포 유도단계에서 Oct4와 Nanog 그리고 Brachyury는 시간-의존적으로 줄어들었다. 4일 동안 중배엽 유도배지로 분화한 세포를 중배엽 후기와 조혈모세포 관련 표지인자인 KDR을 유세포분석기로 확인해 봤을 때, MIM-1과 MIM-2보다 MIM-3에서 더 높게 발현되었다. 조혈모세포로 유도한 세포에서, 초기 조혈모세포가 증식할 때 나타나는 인자인 HoxB4를 관찰했을 때, HoxB4는 MIM-2에서는 4일보다 7일째 더 높게 발현되었고, MIM-3에서는 7일보다 4일 때, 더 높게 발현되었다. 또한, 유세포분석기로 혈관형성전구체와 혈구조혈전구체 표지인자인 CD34과 CD43, 그리고 조혈모세포의 표지인자인 CD34와 CD45를 분석하였다. 그 결과, MIM-1과 MIM-2에 비해 MIM-3에서 CD34와 CD43 양성세포와 CD34와 CD45 양성세포의 비율이 높은 것을 확인하였다. 마지막으로, 세 가지 조건으로 분화를 유도한 세포가 조혈능을 가지는지 확인하기 위해, 총 14일간 분화를 유도한 세포 중 CD34 양성세포만 수거하여 콜로니 형성 시험을 진행하였다. 콜로니 형성 시험 결과, 세 가지 조건으로 분화를 유도한 세포 모두 다양한 형태의 콜로니를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이 콜로니를 김자 염색하여 다양한 혈구세포로 분화한 것을 확인할 수 있었다. 본 연구는 인간배아줄기세포로부터 임상에 적용 가능한 조혈모세포 분화법을 확립하기위해 세 가지 조건의 배지의 분화효율을 비교하였다. 동물 유래인자를 최대한 배제하였고, 분화기간을 단축한 분화배지 조건을 확립하였으며, 분화 유도된 세포가 조혈능까지 가진다는 것을 증명하였다. 그러나 본 분화법들은 낮은 분화효율 등의 문제점을 노출하였다. 따라서 분화를 유도하는 사이토카인과 메카니즘에 대한 지속적인 연구를 통해 임상에 적용가능한 효율적 분화법이 개발되어야 할 것으로 판단된다.
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